Tecniche al tempo della legge 40 – Analisi dei globuli polari

 

Secondo A Dawson (Reproduction BioMedecine Online,2006,13,104) tutti i metodi di dissezione della zona pellucida possono danneggiare l’oocita e mettere a rischio il successivo sviluppo embrionale. Non esiste una prova certa in favore di un particolare metodo, anche se la maggior parte dei medici preferisce utilizzare il laser, mentre dovrebbe essere considerato sperimentale l’uso di acidi, sul quale non sono state fatte valutazioni specifiche. Sempre secondo Dawson, il beneficio dello screening delle aneuploidie è comunque molto modesto, per le notevoli probabilità di errore, per l’elevato numero di embrioni giudicato normale che non si impianta e per le frequenti false-positività. Le tecniche utilizzate necessitano di molti oociti, non sempre recuperabili nelle donne meno giovani. Insomma, deve essere ancora dimostrata l’esistenza di un vantaggio, in termini di percentuale di gravidanze, di abortività e di normalità dei feti.

           Se si cercano mutazioni monogeniche è sempre necessario analizzare i due globuli polari in sequenza. Se si riscontrano entrambi gli alleli – quello normale e quello mutato – nel PB1 eterozigote, mentre nel PB2 c’è l’allele mutante, non vi è dubbio circa il fatto che il contributo dell’oocita al genoma dell’embrione è normale. In alternativa, si può considerare normale un oocita nel caso in cui il suo PB1 sia omozigote mutante, nel qual caso il PB2 dovrebbe essere omozigote normale, simile al pronucleo materno. D’altra parte il genotipo dell’oocita potrebbe essere alterato se il PB1 fosse in effetti eterozigote, ma diagnosticato come omozigote normale a causa di una amplificazione preferenziale o di un drop-out di un allele. In questo caso la presenza di un allele normale nel PB2 denuncerebbe la presenza dell’allele mutante nell’oocita. Così, gli embrioni che prendono origine da oociti con PB1 omozigote per la mutazione non si possono trasferire, a meno che lo stato eterozigote del globulo polare non possa essere escluso dall’uso di marcatori collegati.

                Se l’analisi genetica è indirizzata alla ricerca delle aneuploidie, si eseguono studi dei due globuli polari utilizzando sonde commerciali specifiche per i cromosomi 13, 16, 18, 21 e 22 o ricorrendo al CGH (Comparative Genomic Hibridization). L’analisi del primo globulo polare è stata la prima utilizzata per la ricerca delle traslocazioni, visto che esso non forma mai un nucleo interfase ed è costituito da cromosomi in metafase. I cromosomi possono essere identificati nel PB1 dopo 2 o 3 ore di coltura in vitro e la loro degenerazione inizia 6-7 ore dopo l’estrusione. È così possibile applicare tecniche utili per l’analisi dell’intero patrimonio cromosomico o soltanto per parti specifiche dei cromosomi. La tecnica è soggetta a errore per malsegregazione o per ricombinazione dei cromatidi così che, per poter predire le conseguenze della seconda divisione meiotica, è necessaria l’analisi del PB2, un metodo reso poco efficiente dal fatto che in questo globulo polare i piatti metafasici non sono più del 60%.

In questi ultimi tempi sono state messe a punto nuove tecniche d’indagine, quali la CenM – FISH (Centromere – specific Multiplex Fluorescence in Situ Hybridization), che esamina l’intero complemento cromosomico degli oociti in metafase II e la CGH . Le indagini sui due globuli polari sono particolarmente utili nei casi di malattie genetiche legate al cromosoma X, con differenti tipi di trasmissione. Così le tecniche sono state utilizzate in caso di deficit di ornitina-transcarbamilasi e di idrocefalo trasmesso con il cromosoma X.

E’ dunque ormai evidente che la FISH ha molti limiti, il più importante dei quali consiste certamente nella sua incapacità di valutare tutti i 23 cromosomi. Così, oltre alla CenM-FISH sono state introdotte alcune nuove tecniche che consentono di superare queste difficoltà: le più promettenti sono la CGH (Comparative Genomic Hybridization), l’SK (Spectral Karyotyping), il PRINS ( Primed in Situ Labeling) e il PNA ( Peptide Nuclear Acid). E’ chiaro che l’utilizzazione di queste tecniche avrebbe senso soprattutto se si potesse esser certi che l’aneuploidia degli embrioni è soprattutto di origine meiotica e che l’aneuploidia degli oociti si ritrova inevitabilmente negli embrioni che da loro prendono origine.

Con la CGH, G.Sher (Fertility and Sterility, 2007, 20,1067) esaminando il genoma dei due globuli polari ha trovato che il 65% degli oociti erano aneuploidi, che il 95% degli oociti euploidi dava origine a embrioni ugualmente euploidi, quasi tutti in grado di proseguire nello sviluppo fino allo stadio di blastocisti. Il notevole numero di alterazioni genetiche osservate negli oociti in metafasi II è sorprendente, soprattutto tenendo conto del fatto che l’età media delle donne che hanno preso parte allo studio era di soli 27 anni. Le aneuploidie più frequentemente rilevate erano trisomie dei cromosomi 4,5,16 e 22. Tutte le anomalie di numero dei cromosomi riscontrate negli oociti erano presenti anche dopo la fecondaziome negli embrioni che ne derivavano; inltre il 95% degli embrioni che non si sviluppavano fino allo stadio di blastocisti erano aneuploidi. Infine, lo studio di Sher attribuisce scarsa importanza al mosaicismo, presente solo nel 13% dei casi. Se quuesta risultati verranno confermati, la selezione degli oociti potrebbe diventare parte integrante delle tecniche di PMA, con effetti straordinari sulla percentuale di successi e con importante impatto economico, in quanto potrebbe determinare una significativa riduzione dei costi.